Микроскоп (иммерсия объектива микроскопа)

Микроскоп это оптический прибор для получения (мнимого изображения) его возможность к увеличению ограничивается дифракционными явлениями так они ограничивают полезное увеличение этого микроскопа.

Бывают микроскопы:

1. Простейшие.
2. Медицинские.
3. Электронные.
4. Измерительные и некоторые другие.

Служит средством анализа исследуемой поверхности и как самостоятельная единица не может служить средством измерения, но к примеру связь микроскопа с (вычислительными машинами) используется как средство измерения.

Что такое микроскоп

Оптическая система строения  микроскопа состоит из двух линз:

1. Объектива.
2. Окуляра.

Схематизируя явление, можно сказать, что объектив дает промежуточное действительное увеличенное изображение предмета, которое рассматривается в окуляр как в лупу.

Окуляр образует еще более увеличенное мнимое изображение, которое воспринимается глазом.

Рассмотрим несколько подробнее вопрос о восприятии глазом изображения, образуемого окуляром.

В простейшем виде окуляр представляет собой собирающую линзу, которую помещают перед глазом так, чтобы ее задний главный фокус находился вблизи оптического центра глаза.

А рассматриваемый предмет был расположен несколько ближе переднего главного фокуса. 

Лучи, исходящие из точек предмета, преломляются в линзе и выходят из нее слегка расходящимся пучком.

Вступая в глаз, лучи преломляются в его средах и пересекаются на сетчатой оболочке, образуя действительное изображение предмета.

Значительно увеличенное по сравнению с тем, которое получилось бы при наблюдении предмета невооруженным глазом.

Окуляр микроскопа образует мнимое изображение, величину которого нельзя непосредственно измерить.

Для того чтобы судить о достигаемом при этом увеличении, вводят понятие об угловом увеличении оптического прибора.

Угловое увеличение k_уг численно равняется отношению угла зрения β_пр на предмет, когда он рассматривается с помощью оптического прибора, к углу зрения β_гл на этот же предмет при наблюдении его невооруженным глазом: 

k_уг = β_пр/β_гл

Угловое увеличение показывает, во сколько раз величина изображения предмета на сетчатке глаза в первом случае больше, чем во втором.

Ход лучей через окуляр микроскопа

Рассмотрим ход лучей через окуляр и глаз при построении изображения от предмета в виде стрелки А Б (рис. 2).

Оптический центр глаза совместим с задним главным фокусом окуляра.

Тогда луч, исходящий из точки Б и параллельный главной оси линзы, после преломления в ней пройдет через оптический центр О глаза и, не изменяя направления, упадет на сетчатую оболочку глаза в точке Б». 

По условиям хода луча эта точка должна быть действительным изображением точки Б предмета.

Второй луч из точки Б пройдет через оптический центр О линзы и преломится в оптических средах глаза так, чтобы пересечься с первым лучом в той же точке Б».

Точку Б»» глаз относит к точке Б’ мнимого изображения точки Б.

Угол зрения глаза, вооруженного окуляром, есть угол β’.

Из ∆O’Оb, принимая во внимание, что Ob = А Б = d, тангенс угла р’ равен отношению величины d предмета к фокусному расстоянию f линзы:

tgβ’ = d/f.

При наблюдении невооруженным глазом предмет располагается на расстоянии наилучшего зрения s.

В этом случае тангенс угла зрения β (рис. 2) определится как отношение величины предмета к расстоянию наилучшего зрения:

tgβ =d/s.

Тогда угловое увеличение окуляра (по малости углы зрения можно заменить их тангенсами):

k _ок = β’/β = tgβ’/tgβ = d/f : d/s = s/f

Увеличение окуляра

Увеличение окуляра микроскопа равняется отношению расстояния наилучшего зрения (25см) к фокусному расстоянию линзы (точность формулы тем выше, чем меньше фокусное расстояние линзы сравнительно с расстоянием s = 25 см).

Окуляр (лупа) может давать увеличение до 15 — 20 раз.

Увеличение, достигаемое с помощью окуляра, можно определить в следующем опыте (рис. 3).

На оптической скамье С, несколько ближе переднего главного фокуса линзы Л, служащей окуляром, помещается достаточно освещенный предмет П.

Например черная стрелка на белой линейке (или на матовом стекле, освещенном с обратной стороны).

Глаз Г располагается вдоль главной оси линзы Л на расстоянии, примерно равном фокусному расстоянию линзы.

Несколько сбоку на оптической скамье на расстоянии s = 25 см от глаза помещают вертикально масштабную линейку М с делениями и нанесенной на нее такой же величины d стрелкой.

Затем наблюдают совместно линейку и изображение, которое дает окуляр.

Отмечают на линейке отрезок d’, который глазу представляется равным по величине наблюдаемому изображению.

Этот отрезок определяется углом зрения, под которым глаз видит мнимое изображение стрелки.

В то же время самой стрелке, нанесенной на линейке, соответствует угол зрения на нее невооруженным глазом.

Нетрудно заключить, что отношение величин отрезка d’ и стрелки d будет численно равно угловому увеличению k_ок окуляра: 

k_ок = β’/β ≈ tgβ’/tgβ = d‘/d.

Увеличение микроскопа

Предмет А Б помещается несколько дальше переднего главного фокуса объектива.

При этом плоскость промежуточного изображения А ‘Б’ находится за двойным фокусным расстоянием объектива.

Окуляр Ok располагается так, чтобы эта плоскость была несколько ближе к линзе, чем передний главный фокус окуляра.

Ход лучей через окуляр и глаз может быть построен упрощенно в соответствии с рис, 2, при этом промежуточное изображение А’ Б‘ рассматривается как предмет, расположенный перед окуляром.

Таким путем находятся точки Б»’ изображения на сетчатке и Б» — мнимого изображения.

Если при этом желательно показать также и действительный ход лучей, образовавших точку Б’ промежуточного изображения, то из точки Б» проводятся линии Б»а и Б»b к точкам а и b пересечения продолжения лучей с главной плоскостью окуляра.

Дальше лучи строятся как продолжение этих линий до пересечения с главной плоскостью глаза, а затем непосредственно к точке Б»’.

Работа микроскопа по правилам

Через оптический центр О’ окуляра проводятся побочные оси, параллельные этим лучам до пересечения в точках с и d с фокальной плоскостью MN окуляра.

В данном случае совпадающей с главной плоскостью глаза.

Рассматриваемые лучи проходят через эти точки как через фокусы.

Дальнейший ход этих лучей определится аналогично путем построения параллельных им побочных осей через оптический центр О глаза до пересечения с фокальной плоскостью Ф_гл глаза и т. д.

Угловое увеличение микроскопа k_м численно равняется произведению линейного увеличения объектива k_об и углового увеличения окуляра:

k_ок: k_м = k_об • k_ок.

Линейное увеличение линзы, как указывалось, k = b/a.

Применяя эту формулу к объективу микроскопа, можно считать расстояние а от предмета до объектива равным фокусному расстоянию объектива:

а = f₁.

Расстояние от объектива до изображения равняется сумме фокусного расстояния объектива f₁ и так называемой оптической длины тубуса L₀ (расстояние между задним главным фокусом объектива и передним главным фокусом окуляра):

b = f₁ + L₀

или, пренебрегая фокусным расстоянием объектива по сравнению с оптической длиной тубуса (последняя обычно в десятки раз больше):

b ≈ L₀.

Тогда увеличение объектива:

k_ок = (f₁ + L₀)/f₁ ≈ L₀/f₁

Увеличение окуляра:

k_ок = s/f₂ , где f₂ — фокусное расстояние окуляра.

Следовательно, увеличение микроскопа:

k_м = k_об • k_ок = (L₀s)/f₁f₂

Увеличение микроскопа равняется отношению произведения оптической длины тубуса на расстояние наилучшего зрения к произведению фокусных расстояний объектива и окуляра.

Увеличение объектива и окуляра называется их собственным увеличением и указывается на оправе линз.

Свойства микроскопа

Свойства простейшего микроскопа с небольшим увеличением можно изучить на модели, подобной модели (рис. 3), которая дополнена второй линзой — объективом.

Перед объективом на соответствующем расстоянии располагается наблюдаемый предмет.

Пользуясь масштабной линейкой М, расположенной сбоку на расстоянии 25 см, и сравнивая величину отрезка d’, соответствующего углу зрения β’ на мнимое изображение.

Образуемое микроскопом, с величиной d самой стрелки, можно, аналогично предыдущему случаю, определить увеличение микроскопа:

k_м = d’/d .

На рисунке обозначено: П — предмет, О — осветитель, Об — объектив, Ок — окуляр, М — масштабная линейка.

Разрешающая способность микроскопа

Соответствующим подбором линз можно обеспечить весьма большое увеличение оптического микроскопа (несколько тысяч раз).

Однако это может быть бесполезно, так как возможность различения мелких деталей предмета ограничивается дифракционными явлениями.

Эти явления ограничивают полезное увеличение микроскопа и учитываются с помощью понятия о его разрешающей способности.

При прохождении света через мельчайшие детали предмета происходит дифракция, в результате которой при определенных условиях изображение этих деталей может терять резкость контуров.

Может иметь место нарушение подобия изображения предмету и, наконец, изображение может вообще не получиться.

Поэтому, например, в оптическом микроскопе нельзя увидеть фильтрующиеся вирусы, отдельные белковые молекулы и т. п.

Свойства оптической системы давать изображение достаточно мелких объектов без нарушения подобия их предмету называют разрешающей способностью системы.

Разрешающая способность характеризуется пределом разрешения или наименьшим расстоянием между двумя светящимися (или освещенными) точками, изображение которых в данной оптической системе наблюдается раздельно.

Чем меньше предел разрешения z, тем выше разрешающая способность оптического прибора.

Применяя это к микроскопированию биологических объектов, можно считать, что предел разрешения обусловливает наименьшую величину тек структурных деталей которые могут различаться в препарате.

Теория разрешения микроскопа

Теория разрешающей способности микроскопа разработана Э. Аббе, а затем советскими физиками Л. И. Мандельштамом и Д. С. Рождественским.

Выводами этой теории и пользуются на практике.

Для лучшего понимания этих выводов и особенно для выяснения значения апертурного угла объектива для разрешающей способности микроскопа, рассмотрим этот вопрос предварительно в более упрощенной форме.

Рассмотрим образование с помощью объектива изображения светящегося отверстия S достаточно малого диаметра d, на которое падает пучок параллельных монохроматических лучей (рис. 4).

Проходя через отверстие, свет испытывает дифракцию и лучи его отклоняются в стороны.

Объектив собирает отклонившиеся лучи и в сопряженной плоскости образует изображение отверстия.

При этом можно рассмотреть два случая.

Первый, когда апертурный угол объектива ϴ больше угла α дифракции лучей, тогда все дифрагировавшие лучи собираются объективом и принимают участие в образовании изображения (рис. 4, а).

В этом случае оно будет геометрически во всем подобно предмету.

Второй случай, когда апертурный угол ϴ объектива меньше угла а дифракции лучей, тогда не все исходящие из отверстия лучи собираются объективом и принимают участие в образовании изображения (рис. 4, б).

В этом случае можно ожидать, что изображение не будет полностью геометрически подобно предмету.

Степень нарушения подобия будет зависеть от того, какая часть дифрагировавших лучей не примет участия в образовании изображения.

Для того чтобы все отклонившиеся лучи были собраны объективом, необходимо чтобы его апертурный угол ϴ был не меньше угла а дифракции или в пределе был ему равен:

ϴ = α.

Угол а отклонения лучей при дифракции тем больше, чем больше длина волны λ и чем меньше диаметр d отверстия.

Допустим для наших упрощенных рассуждений, что между величинами α и λ существует прямая и между α и d обратная пропорциональность, т. е. α ≈ λ/d.

Заменяя на основании вышесказанного угол дифракции α апертурным углом ϴ, получим ϴ ≈ λ/d, откуда d ≈ λ/ϴ.

Таким образом, диаметр d отверстия, при котором обеспечивается подобие между изображением и предметом, может быть тем меньше, чем короче длина волны λ и чем больше апертурный угол ϴ объектива.

Пример падения лучей на отверстие

Посмотрим, какой вид примут эти соотношения в случае наклонного падения лучей на отверстие. Угол наклона лучей сделаем равным апертурному углу.

Будем считать достаточным условием для сохранения подобия между изображением и предметом попадания в объектив всех дифрагировавших лучей хотя бы по одну сторону от первоначального направления.

При этом, как видно из рисунка, необходимо, чтобы апертурный угол ϴ был не меньше половины угла α дифракции:

ϴ = α/2; 

Тогда аналогично предыдущему можно получить соотношение:

d ≈ λ/2ϴ.

Следовательно, в данном случае условия разрешения улучшаются.

Перенося наши рассуждения на условия микроскопирования, можно считать, что диаметр d отверстия соответствует наименьшей величине структурных деталей препарата, т. е. принять его за предел разрешения микроскопа d = z.

Тогда можно сказать, что предел разрешения будет тем меньше, чем короче длина волны λ света и чем больше апертурный угол в объектива, с помощью которого образуется изображение.

При прямом падении лучей z ≈ λ/ϴ и при наклонном (под углом равным ϴ) падении лучей:

z ≈ λ/2ϴ

Теория Аббе

В теории Аббе микроскопируемый предмет уподобляется дифракционной решетке и рассматриваются условия образования ее изображения с помощью объектива.

Пусть решетка освещена пучком перпендикулярно падающих на нее параллельных лучей монохроматического света.

Лучи, претерпевшие дифракцию на щелях решетки Р, собираются объективом Л в его фокальной плоскости, образуя систему дифракционных максимумов (0,1 и 1′, 2 и 2′ , 3 и 3‘ и т. д.).

За фокальной плоскостью лучи, идущие от максимумов различного порядка, опять расходятся, интерферируют между собой и падая на экран Э, расположенный в сопряженной плоскости, дают изображение решетки.

Если в этом участвуют лучи от всех максимумов, изображение решетки будет достаточно резким.

Если задержать лучи от максимумов высших порядков, то изображение решетки потеряет в резкости, но может быть еще приемлемым, если в нем различаются отдельные щели, т. е. выполняется условие их разрешения.

Согласно теории Аббе для этого необходимо, чтобы в образовании изображения решетки участвовали лучи не меньше, чем от нулевого максимума и максимума первого порядка, хотя бы с одной стороны.

Если задержать лучи от всех максимумов, кроме нулевого, то изображения не получится, так как на экран будут падать прямые, не пересекающиеся между собой лучи, которые создадут только равномерную освещенность экрана.

Пример разрешения микроскопа

Указанные явления можно показать на опыте. Спроектируем при помощи объектива Л на экран Э изображение сетки С из тонких вертикальных проволок (сетка в данном случае служит дифракционной решеткой).

Осветив ее с помощью конденсора К сходящимся пучком света (при наклонном падении лучей, которое дает сходящийся пучок, дифракцию света можно наблюдать на более грубых объектах).

Поместим в фокальной плоскости объектива параллельно вертикальным проволокам сетки щелевую диафрагму Д и будем постепенно суживать ее щель.

При этом диафрагма будет ограничивать количество дифракционных максимумов, лучи от которых участвуют в изображении вертикальных проволок сетки (горизонтальных проволок, оставленных для контроля по сторонам сетки, это касаться не будет).

Вначале изображение сетки только теряет в яркости.

При достаточном сужении щели изображение теряет резкость, но проволоки в нем еще разрешены, при еще большем сужении щели изображение проволок бледнеет, расплывается и, наконец, исчезает.

Такие же результаты можно получить, если вместо задержания лучей от боковых максимумов с помощью диафрагмы ограничить доступ в линзу лучей, образующих эти максимумы, путем сужения апертурного угла объектива.

Для разрешения щелей в изображении дифракционной решетки по теории Аббе необходимо, чтобы в образовании ее изображения участвовали лучи от максимумов нулевого и первого порядка.

Для этого направления лучей, образующих эти максимумы, должны лежать в пределах апертурного угла объектива.

Другими словами, апертурный угол объектива ϴ должен быть больше или в пределе, равен углу а₄ отклонения лучей, образующих максимум 1-го порядка:

ϴ = α₄.

Предел разрешения в этом случае может быть приравнен периоду решетки:

z = d.

Тогда, используя формулу дифракционной решетки и подставляя в нее указанные величины, получим:

z = λ/sinϴ

Предел разрешения численно равен отношению длины волны света к синусу апертурного угла объектива.

Это — в случае перпендикулярного падения света на предмет, что имеет место только в простейших микроскопах.

В более совершенных микроскопах предмет освещается сходящимся пучком лучей, образуемым с помощью конденсора К.

При этом вследствие концентрации света на небольшом участке предмета значительно повышается яркость изображения, а в связи с наклонным падением лучей улучшаются условия разрешения.

Угол падения лучей на плоскость предмета в этом случае обусловлен выходным углом φ конденсора.

Однако лучи света от конденсора входят в объектив только в пределах апертурного угла ϴ объектива.

Поэтому угол ϴ надо считать наибольшим углом наклона лучей к плоскости предмета.

При падении лучей на дифракционную решетку под углом φ направление на максимум первого порядка обусловлено выражением: 

d (sin α’₁ + sin φ) = φ. 

Используя эту формулу в теории Аббе, надо заменить угол дифракции α’₁ на апертурный угол ϴ.

Принять во внимание, что угол падения лучей φ также равен апертурному углу ϴ и приравнять период решетки d пределу разрешения z.

В результате получим:

z = d = λ/sin ϴ.

Предел разрешения объектива при наклонном освещении предмета численно равен отношению длины волны света к удвоенному синусу апертурного угла объектива.

Иммерсия объектива

Дальнейшим усовершенствованием микроскопа явилось применение иммерсии объектива.

Иммерсия еще больше повышает яркость изображения и улучшает разрешающую способность объектива.

Иммерсия заключается в том, что между предметом и объективом помещается капля жидкости, показатель преломления которой близок к показателю преломления стекла.

Например, глицерина (п = 1,45), кедрового масла (п = 1,51) или монобромнафталина (п = 1,66).

Ход световых лучей сравнительно в простом (сухом) и в иммерсионном объективах показан на рис. 5, на котором обозначено:

1. П — препарат.
2. С — покровное стекло.
3. И — иммерсионная среда.
4. О — фронтальная линза объектива.
5. К — конденсор.

При наличии между покровным стеклом и объективом воздуха лучи, падающие на препарат под углом, большим предельного р.

Испытывают на границе стекла и воздуха полное внутреннее отражение (рис. 5, а); отражение лучей происходит также и от наружной поверхности объектива.

В иммерсионном объективе свет от предмета до объектива проходит по оптически однородной среде и не испытывает отражения (рис. 5, б).

Это значительно повышает яркость изображения, что имеет существенное значение для микроскопа с большим увеличением.

Например, для микроскопа с увеличением в 400 раз площадь изображения по сравнению с площадью предмета увеличивается в 160 000 раз.

Во столько же раз уменьшается его яркость по сравнению с яркостью предмета.

Предел разрешения иммерсионного объектива

Для иммерсионного объектива, при котором между предметом и первой линзой находится не воздух, а среда с показателем преломления п, длина волны λ_n света, падающего на объектив:

λ_n = λ/n ,

где λ — длина волны света в воздухе.

Подставляя эти данные в формулу для предела разрешения, получим:

z = λ_n/2sin θ = λ/2nsinθ

то есть

Предел разрешения иммерсионного объектива при наклонном освещении предмета численно равен отношению длины волны света к удвоенному произведению показателя преломления иммерсионной среды на синус апертурного угла объектива.

Величина А = sin θ для сухого или А_п = n sin θ для иммерсионного объектива называется числовой апертурой и для сухого объектива обозначается на его оправе вместе с увеличением.

Учитывая это, можно сказать, что предел разрешения микроскопа равняется длине волны света, при котором производится наблюдение.

Деленной на числовую апертуру при перпендикулярном падении света на предмет z = λ/A, или деленной на удвоенную числовую апертуру при наклонном освещении z = λ/2A

Числовая апертура объектива характеризует предел разрешения всего микроскопа, так как последующие линзы в силу устройства прибора имеют большие апертуры.

Она позволяет сравнивать между собой разрешающую способность различных микроскопов.

Последняя тем выше, чем больше апертура.

Апертурный угол может иметь величину до 70°, тогда для сухого объектива числовая апертура А = sin θ = sin 70° = 0,94.

Для иммерсионного объектива при п= 1,5 числовая апертура А_п =пА = 1,5•0,94 = 1,4.

Тогда при освещении предмета белым светом, считая X = 0,555 мк (длина волны, к которой глаз наиболее чувствителен).

Предел разрешения для сухого микроскопа при прямом освещении z ≈ 0,5 мк, при наклонном освещении z ≈ 0,3 мк и для иммерсионного объектива z ≈ 0,2 мк.

Дальнейшее повышение разрешающей способности оптического микроскопа может быть достигнуто только путем уменьшения длины волны света.

С помощью которого производится исследование, например, путем применения ультрафиолетового излучения и фотографирования наблюдаемых объектов.

Для этого имеются специальные микроскопы с кварцевой оптикой.

Статья на тему Микроскоп